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今日快讯:动物组织样本的前处理方法

阅读人数:829 发布时间:2019/2/22 15:11:05

  一、匀浆介质的制备:

    一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化钠溶液或直接用0.86%的生理盐水作为匀浆介质。

二、组织匀浆的制备

    1、取组织块(0.1g0.2g*少可到25mg在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,准确称重,放入5ml的匀浆管中。

    2、按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质(pH7.4, 0.01mol/L Tris-HCl1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠溶液)或者0.86%的生理盐水于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

    3、匀浆的方式有多种:手工匀浆,机器匀浆,超声粉碎。

    ① 手工匀浆:左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(68分钟),充分研碎,制成10%的匀浆液。

    ② 机器匀浆:用组织捣碎机1000015000 /分 上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10/次,间隙30秒,连续35次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

    ③ 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用400安培,5/次,间隙10秒反复35次。

    镜检观察:取少量组织匀浆作涂片(直接涂片、染色均可以),显微镜下观察细胞是否破碎,若没有则可延长匀浆时间。

    4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500/分左右,离心1015分钟,取上清液进行测定.

三、样本保存:

    动物组织样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间如不反复冻融,-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。

    制备好的匀浆液建议不要冻存,当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降,部分指标4℃可存放35(SOD要存放23,MDA可存放35,总蛋白测定可5-7天)

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