免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。0 x+ W+ F9 Q) {/ h4 S1 V
1．原理
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP）
辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质，HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，Mr在40000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0 =-0.2070V，pH为7.71时，E′0 =-0.2787V。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。% O+ R( k8 y, u& R! }
酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：3 D/ Y2 U# ~ S d( r* a" Z X8 g
(1)来源方便，易于纯化；
(2)比活性高，性质稳定；9 z& g$ X- l$ D) C9 r# U7 a0 C
(3)酶活性和量能+ I w/ ^& O9 ]
用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。8 ]- v7 V! ~( c( E- }" W$ A: e" I" s
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。* k4 |7 U# q# b% ^- t"
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP2 ~2 y( w9 E+ M
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。+ c0 `# W2 }$ k* k& p
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2．实验步骤- W a$ D( e2 i0 b
HRP的制备
1).水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎1～2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。. K0 p3 I5 F1 U" R: J
2).硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度，0℃)，大约在1~2h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1～2天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。 0 c4 N; R: ^/ ~: F! T$ J7 G
3).丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。
4).精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。 3 y; ~/ O3 z+ B& A1 d
（1）戊二醛二步法) M ~0 L+ l# k! D
1） 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。6 C, Q8 j& r" m
2）标记步骤：
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。5 k* k) F9 F5 V%
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。: e6 V. j! |, b8 _
(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。) K+ P! L- q7 ]: j" q3 |3 d+ J# c3 j
(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。+ Y( I* K3 j# M+ ]
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。6 s* w9 j F" v4 N9 R- A+ ~
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3）结果判定：5 l5 y# N% b0 A* V" T2 w5 b. ) B
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。) y# a) a- z1 u5 t) t# Y4 N0 y/ u
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程25px)。6 o! G4 ]6 }3 }! K* E: P
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.48 z& Q/ M8 t3 [# D0 R) i5 k h/
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 49 S- O, `! i8 w
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2~4％的酶与蛋白质结合。
4）试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。% ]# ^- G3 @- p1 n. x
(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。" D1 w8 , r& A2 Q
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。9 H7 O2 f o0 {( {# M" M N
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。& y" t* I1 j! L" t- M- W7 r9 R
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25层析柱(50px×1250px)。
(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。0 c3 J, R3 p. c W$ J, T0 I: B
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
r& i% D. }& q: Z K9 e! E0 d
（2）简易过碘酸钠法% E0 O+ v: s2 T
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。7 p3 C# @, w9 L5 i% F% @7 r9 Z
1）原理：; h d) X" E" u _& O5 y
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2）标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。1 U0 |) i L/ Y/ ?. ]
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。: |+ }% L" N7 ?4 e2 g
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。9 U# ^& ~. [7 @
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。# B+ T" n; v7 C" F* H5 }
(6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。0 m# a# G5 V# x, S7 p, B
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
3）结果判定：
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。5 {% ^% U/ T X- Z0 U- a
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62( Q: p$ f" X, F0 }; s
4）试剂及器材:1 x- R+ T/ e$ i" Q
(1) 0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: ?. p" N) ?( K
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml+ r% g; o& m2 r7 t4 O
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:3 ?! $ z* p7 ]" g& X. E) z( f
Na２CO３ 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {
NaHCO３ 0.586克: H% E M! O w- M
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。+ h( i* [6 J, H% T
(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。! C$ F/ f. C( I1 f# U0 m5 J7 T, p
3．工作浓度的选择
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。$ J/ A& ]3 Y: S
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。( U3 Z* A4 l o$ {/ f0 M0 _
4．注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。" i! t$ {2 f0 g8 |
2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3 e0 t3 r9 d/ K+ H9 O; J l
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
